(Ondřej Prášil – MBÚ)
Úspěch našeho projektu vyžaduje kultivaci, manipulaci a rychlou analýzu tisíců mutantních kmenů sinic a řas pěstovaných za přesně kontrolovaných podmínek. Automatizovaná fenotypizace řas a sinic je nezbytná pro rychlou a účinnou charakterizaci náhodných a cílených mutant a pro výběr vysoce produktivních kmenů. Neexistují komerčně dostupná robotická řešení, která by splňovala všechny požadované úkoly: kultivaci, manipulaci a podrobnou analýzu v měřítku očekávané v projektu. V rámci tohoto projektu proto vyvineme robotický systém AlgaScreen pro automatizovanou kultivaci, manipulaci a základní charakterizaci kmenů sinic/řas na agaru nebo kultivačních destičkách. Systém bude vybaven novými senzorovými stanicemi a umělou inteligencí a vytvoří tak unikátní, plně automatizovanou fenotypizační linku. Nové optické senzory budou schopny detekovat a kvantifikovat fykobilisomy a fluorescenční proteiny, jakož i obsah lipidů, sacharidů a metabolických produktů v analyzovaných mutantních buňkách.
(Vendula Krynická – MBÚ)
Tlak na fototrofní buňku k hromadění velkého množství bioproduktů nevyhnutelně vede ke konfliktu při rozdělování živin, protože růst i produkce využívají stejné, limitující zdroje. Abychom tento problém vyřešili, přeprogramujeme Synechocystis tak, aby byla přepínatelná na geneticky integrovaný program přežití. Po aktivaci tohoto programu buňky přesměrují metabolity uhlíku a dusíku (C/N), včetně aminokyselin a bilinů uložených ve světlosběrných anténách, do zásobních polymerů. Aby se zabránilo dalším investicím buněk do biomasy, bude růst v produkční fázi blokován. Základní prototyp Syn2Cell, zkonstruovaný v první fázi projektu, bude zdokonalen pomocí vysoce výkonných screenovacích technik a také pokrokem v dalších úkolech projektu.
(Josef Komenda – MBÚ)
Program přežití, který se aktivuje u sinic v podmínkách nedostatku živin, způsobuje degradaci fotosyntetického aparátu. Vzhledem k tomu, že modifikovaný program přežívání bude využit v buňkách Syn2Cells (úkol 1.2) k přesměrování metabolitů do bioproduktů, je zásadní zlepšit stabilitu fotosyntetického aparátu během produkční fáze. Za tímto účelem identifikujeme rozhodující proteinové faktory, které kontrolují akumulaci a kontrolu kvality obou fotosystémů. Případné odstranění, modifikace nebo zvýšená akumulace těchto faktorů by měla vést k udržení aktivní fotosyntézy i po napodobení nedostatku dusíku analogem oxoglutarátu. Současně využijeme strategii náhodné/cílené mutageneze a specifické selekce kolonií, které si udrží vysokou fotosyntetickou aktivitu i během podmínek živinového stresu. Výsledkem kombinace těchto dvou přístupů by měl být nakonec prototyp Syn2Cell s vysokou fotosyntetickou aktivitou.
(Eva Kiss – MBÚ)
Tento úkol je zaměřený na otázku, jak fototrofní buňky regulují centrální metabolismus na posttranslační úrovni, aby usměrnily metabolické toky do zásobníc látek, a jak katabolizují aminokyseliny a biliny uvolněných z jejich obřích světlosběrných antén. Tyto procesy jsou většinou neznámé; výsledky však naznačují, že klíčovou roli hraje striktní posttranslační kontrola enzymů zapojených do centrálních metabolických drah uhlíku a dusíku. Hlavním cílem je prozkoumat dynamiku enzymatických komplexů, která umožňuje metabolickou změnu od rychlého růstu k programu přežití. Identifikujeme regulační funkci interagujících proteinových faktorů, stejně jako význam oligomerizací a posttranslační modifikací centrálních enzymů a jejich proteinových partnerů. Získaný seznam proteinových faktorů a specifických modifikací enzymů bude využitý pro cílenou mutagenezi ke zlepšení vlastností systému Syn2Cell. Získané výsledky poskytnou také ucelený pohled na posttranslační regulaci hladin metabolitů, což je důležité pro odbourání potenciálních úzkých uzlů v metabolismu Syn2Cell.
(Roman Kouřil – UPOL)
Nově nastavený metabolismus buněk Syn2Cell bude vyžadovat optimální regulaci redoxní a ATP homeostázy pro zajištění dostatku energie. Pro toto správné nastavení bude klíčová tvorba nových typů superkomplexů membránových proteinů, a s tím související reorganizace membránových mikrodomén. Za pomocí metod konfokální a elektronové mikroskopie budeme zkoumat strukturální reorganizaci tylakoidních membrán a proteinů fotosyntetického aparátu a díky tomu identifikujeme potenciální genetické cíle pro vyladění energetické homeostázy. Vyřešením tohoto úkolu tak získáme nezbytný soubor dat, který nám umožní upravit energetiku buňky sinic s ohledem na energetické potřeby buňky Syn2Cell.
(Meri Eichner – MBÚ)
V každém mililitru mikrořasové kultury jsou miliony buněk. V posledních letech se ukazuje, že tyto kultury mohou vykazovat značnou heterogenitu mezi buňkami, což znamená, že produkce požadovaných sloučenin se u jednotlivých buněk velmi liší. Pro maximalizaci výnosů bioproduktů v kulturách Syn2Cell (úkol 1.2) je třeba: i) vyloučit buňky, které se nemanifestují požadovanou genetickou modifikaci (“revertanti” a “cheaters”), a ii) selektovat vzácné spontánní mutace s jedinečným fenotypem (“superbuňky”). Za tímto účelem vyvineme velmi výkonný screeningový a selekční přístup kombinující průtokovou cytometrii, třídění buněk a automatickou kultivaci a monitorování.
(Iva Mozgová – BC)
Zelené řasy jsou důležitým zdrojem biomasy pro výrobu biopaliv a krmiv. Řasy sdílejí většinu primárních metabolických drah s prokaryotickými sinicemi, naproti tomu růst, rozdělování biomolekul a buněčné dělení eukaryotických buněk vyžaduje další úroveň koordinace mezi genomy jádra a organel a mezi jejich produkty. To z řas činí dokonalý eukaryotický ekvivalent sinic – sdílejí fototrofii, ale překonávají omezení prokaryotického systému, jako jsou nerozpustnost biosyntetických produktů, problémy se skládáním proteinů, nebo absence některých posttranslačních modifikací. Vzhledem k vyšší složitosti a nedostatečně vyvinutým nástrojům syntetické biotechnologie, není v současné době možné zkonstruovat eukaryotický ekvivalent Syn2Cell. Úkol 1.7 se zaměřuje na pochopení toho, jak evoluční inovace u eukaryot ovlivňují metabolické přepínání mezi růstem a produkcí. Odhalí, jak epigenetické mechanismy přispívají k ustavení růstového a produkčního stavu a ke koordinaci exprese chloroplastového a jaderného genomu. Genetický screening identifikuje nové komponenty signalizace organel, které koordinují růst buněk a akumulaci zásobních látek. To poskytne základ pro aplikaci strategií pro zlepšení primární produkce u sinic na eukaryotické řasy a umožní cílené zlepšení produkční fáze u řas.
(David Bína – JČU)
Světlosběrné komplexy sinic, fykobilisomy (PBS), představují rozsáhlý a rychle rozložitelný zdroj organického uhlíku a dusíkatých molekul, které lze nasměrovat k tvorbě požadovaných bioproduktů (úkol 1.2). Nicméně, pro účinnou fotosyntézu během produkční fáze, v kultuře s vysokou hustotou buněk, vyžadují komplexy PSII vnější anténní systém. Pro tento účel navrhujeme vytvořit antény založené na chlorofylu a karotenoidech, které se funkčně podobají světlosběrným komplexům řas a rostlin. Tato syntetická anténa s vyšší hustotou chromoforů než PBS poskytne stabilní přísun energie ze širšího spektra fotonů, jakmile bude aktivován genetický program pro produkční fázi (viz úkol 1.2, návrh systému Syn2Cell).
(Roman Sobotka – MBÚ)
Syntetická biologie sinic a řas je rychle se rozvíjejícím oborem a pro mikrořasy je k dispozici stále více biologických nástrojů a dalších standardizovaných genetických prvků. Nicméně ve srovnání s široce používanými bakteriálními nebo kvasinkovými systémy je současný soubor molekulárních nástrojů stále poměrně omezený. Obzvláště citelný je chybějící systém pro robustní a velmi silnou genovou expresi u sinic. Nízká akumulace heterogenně exprimovaných proteinů v sinicích je trvalým problémem, nicméně řešitelným pomocí shuttle vektoru s indukovatelným vysokým počtem kopií (HC). Naším cílem je přetvořit plazmid pCC5.2, který je nativně přítomný v Synechocystis, na indukovatelný HC shuttle vektor, který lze udržovat i v E. coli. Výsledný vektor bude využitý pro metabolické inženýrství Synechocystis (vysycení – decoys transkripčních faktorů, úkol 1.2) a pro bioprodukci cenných látek jako je nostatin (viz úkol 2.5).
(Michal Koblížek – MBÚ)
Kromě oxygenních sinic existuje další velká skupina fototrofních mikroorganizmů, které provádějí anoxygenní fototrofii pomocí bakteriochlorofylu. Další fototrofní skupinou jsou bakterie obsahující rhodopsin. Jedná se o metabolicky velmi různorodou skupiny. Některé fototrofní druhy mají jasný biotechnologický potenciál, protože mohou vázat atmosférický dusík nebo produkovat vodík. Některé další druhy mohou produkovat látky podporující růst zemědělských plodin. Jiné druhy produkují široké spektrum karotenoidů s významným biotechnologickým potenciálem. Proto navrhujeme využít robotický system AlgaScreen pro izolaci nových fototrofních organismů. Vybrané kmeny budou osekvenovány a jejich genom anotován. Vybrané metabolické dráhy mohou být využity pro konstrukci modifikované “Syn2Cell” sinice. Pro identifikaci důležitých genů a metabolických drah plánujeme využít metodu založenou na transpozónové mutagenezi. Získané mutanty budou dále testovány pomocí screeningového robota.
(Jan Janouškovec – MBÚ)
Bioprodukci vysoce hodnotných sloučenin často brání malé mezery ve znalostech základní biochemie. Příkladem je biosyntéza fotosyntetických pigmentů, jako jsou chlorofyly a karotenoidy, kde objevy jednotlivých chybějících enzymů mohou revolucionizovat naši schopnost modifikovat metabolismus mikrořas pro produkci cenných sloučenin. V tomto úkolu rozšíříme katalog enzymů pro syntetickou biologii fototrofů pomocí nejmodernějších přístupů hledání zodpovědných genů v genomech a jejich funkčního testování. Výsledkem budou upravené buňky, které exprimují cílové molekuly a mohou být upraveny pro využití v biotechnologiích, medicíně a potravinářském průmyslu.
(Pavel Hrouzek – MBÚ)
Sinice jsou obrovským zdrojem nových chemických látek. Jako prokaryotické organismy disponují vysoce univerzálními biosyntetickými mechanismy, o nichž je známo, že produkují sloučeniny s terapeutickým potenciálem, přičemž mnohé z nich jsou v poslední době v různých fázích klinických zkoušek. V rámci navrhovaného úkolu budeme aplikovat nejmodernější screeningové metody pro vyhledávání molekul aplikovatelných ve dvou mimořádně důležitých oblastech medicínského výzkumu. První z nich zahrnuje hledání inhibitorů quorum-sensingu s potenciálním využitím v anti-virulentní terapii, sloužící ke kontrole rozvoje antimikrobiální rezistence. Ve druhém se zaměříme na sloučeniny s potenciálním využitím jako antiproliferativní látky proti buňkám triple negativního karcinomu prsu, což je onemocnění s nedostatečnými terapeutickým pokrytím.
(Karolína Štěrbová – MBÚ)
Biosyntetický aparát sekundárních metabolitů sinic je obvykle kódován kolokalizovanými geny v tzv. biosyntetických genových klastrech (BGC). Takové uspořádání je výhodné pro identifikaci genů zodpovědných za biosyntézu sloučeniny, ale také zpřístupňuje BGC pro expresi v jiném organismu, protože obvykle obsahuje všechny geny potřebné pro syntézu sloučeniny. V našich předchozích studiích jsme identifikovali několik BGC včetně toho, který kóduje antiproliferativní sloučeninu nostatin A. V rámci tohoto úkolu se zaměříme na pochopení biosyntetických kroků potřebných pro syntézu studovaných bioaktivních metabolitů a také strukturních motivů důležitých pro jejich bioaktivitu. Následně připravíme mutantní kmeny Synechocystis schopné biosyntézy těchto vysoce hodnotných bioaktivních produktů. Tento biotechnologický přístup má v kontextu výše zmíněných molekul značný přínos, jelikož tyto látky jsou poměrně těžce dostupné pro přípravu klasickou organickou syntézu.
